CAF (Cancer associated fibroblast)의 heterogeneity 규명

■ Cancer associated fibroblast (CAF)는 Cancer cell 주변에 있으면서 cancer cell의 진행과 전이를 촉진하는 fibroblast를 가르킴. 그런데 실제 CAF는 한 가지 세포가 아니라 기원세포도 다르고 매우 다양한 subgroup을 가진 것으로 판단되고 있음.  이것은 CAF 연구에 큰 장애로 등장하고 있으며 CAF의 정확한 subgroup을 밝히려는 노력이 진행되었으나 현재까지 별 다른 성과가 없음.

■ CAF의 subgroup을 규명하려는 많은 노력에도 불구하고 거의 성과가 없는 이유는 다음과 같음

  [1] CAF의 배양에 사용되는 FBS (fetal bovine serum)은 CAF의 배양에 꼭 필요하지만 동시에 selection bias를 유발함. 

      -- FBS는 fibroblast를 접촉하는 즉시 대부분을 활성화시키며 fibroblast의 집단분포를 왜곡시킴. 특히 FBS에 대한             반응도는 fibroblast나 CAF마다 매우 다양해 FBS에 잘 반응하는 CAF는 선택적으로 자라는 문제가 있음. 

  [2] CAF나 fibroblast는 마땅한 surface marker가 없음. 

      -- T lymphocyte나 B lymphocyte의 surface marker들, CD3, CD4, CD8, CD25, L26 같은 마커를 CAF에서

         찾아내려는 노력들이 있었으나 별 다른 성과가 없음. 그 이유는 Fibroblast나 CAF의 기능이 immune cell

         과는 달리 ECM분비와 ECM remodeling, 3-dimensional morphogenesis등에 특화되어 있어서 마땅한

         surface marker가 없을 수도 있음.  

  [3] Fibroblast나 CAF의 기능을 평가할 적절한 Test platform이 없음.

     -- 정확한 CAF의 subgroup을 증명하려면 최종적으로 각 subgroup이 고유한 기능을 가지고 있는지 확인해야

        함. 그런데 CAF의 기능은 주변 세포와의 아주 복잡한 상호작용을 통해 나타나므로 현재의 technology로

        CAF의 기능을 제대로 평가할 in vitro 실험을 확립하는 것은 매우 어려우며 사실상 불가능함. CAF 연구는

        현대 과학의 한계에 도전하는 연구임.  

 

■ 본 프로젝트의 목적과 전략

 : 위에서 언급한 문제에도 불구하고 CAF heterogeneity를 규명하는 것은 이 분야 연구에서 가장 근본적이며 중요한 것이므로 본 실험실에는 이 어려운 과제에 도전하고자 함. 그래서 확실한 CAF subtype 또는 CAF lineage를 규명해내는 것을 목표로 하고 있으며 최신 연구기법을 전부 총동원하고 현재 가능한 분석기술의 한계까지 동원할 예정임. 주요전략은 다음과 같음

    [1] Single cell RNA-sequencing : CAF를 FBS로 배양해서 분석하면 배양과정에서 왜곡이 생기는 것을 피할 수

        없으므로 조직을 있는 그대로 각각의 세포 수준으로 분석하는 single cell sequencing을 대대적으로 적용하

        고자 함.

본 실험실에서 마우스의 피부에 직경 10 mm의 상처를 내고 10일째가 되었을때 아물고 있는 상처부위의 세포를 single cell RNA-seq으로 분석함. 상처 부위의 세포들이 하나하나 각각 RNA-seq이 되어 분석됨을 확인할 수 있음. 

   [2]Lineage-tracing genetically engineered mice model : 그런데 실제 fibroblast나 CAF의 행동패턴은 CAF

       단독이 아니라 주변의 다른 세포들 특히 epithelial cell, 및 세포외 기질 (extracellular matrix)에 의해 

       크게 영향을 받음. 이러한 복잡한 요인들은 아무리 organoid culture를 업그레이드한다 해도 절대로

       재현할 수 없으며 현재로서는 유전자 변형 마우스를 이용한 실험만이 유일한 대안임.

       -일반적인 conditional knock-out mice나 conditional inducible mouse외에 Prrx1-enhancer-GFP

       reporter mouse를 이용한 lineage-tracing mouse가 가장 강력한 연구수단으로 떠오르고 있으며

       본 연구실에서는 필요한 마우스 라인을 이미 확보한 상태임.

본 실험실에서 보유하고 있는 fibroblast specific target gene knock-out mouse 모델. 먼저 fibroblast에서만 활성화되는 FSP1-promoter를 이용하여 fibroblast에서만 Cre enzyme이 만들어지는 쥐를 만든다. 그 다음 이 Cre enzyme은 CAS9 promoter에 있는 stop codon을 제거하여 CAS9이 항상 만들어지게 한다. 그리고 외부에서 target gene을 인지하는 single guided RNA를 주사함으로 CAS9이 target gene을 잘라내고 knock-out이 완성되게 된다. 

    [3] Multiplex IHC (immunohistochemistry) : 위에서 언급한 Single cell sequencing은 매우 강력한 연구도구

         이나 cell의 clustering이 RNA 발현패턴에 따른 자의적인 구분이고 공간적인 세포의 배치는 전혀 알 수 

         없음. 이를 보완하기 위해 세포에 있는 그대로두고 여러개의 marker를 동시에 분석하는 multiplex IHC가

         연구에 꼭 필요함.

본 실험실에서 확립한 Multiplex IHC의 진행 프로토콜